Quelles sont les étapes du Western blotting ?

Le Western blotting est une technique de détection de protéines inventée par l'Américain George Stark. Il utilise la technologie d'électrophorèse pour séparer les protéines de tissus ou de cellules spécifiques, les fixer sur des membranes NC ou des membranes PVDF, puis utilise des anticorps spécifiques pour détecter des antigènes spécifiques. Parce que cette technologie permet de détecter les antigènes responsables des maladies, elle est désormais largement utilisée dans de nombreux domaines biologiques tels que le diagnostic des maladies. Jetons un œil aux étapes de fabrication des pieds de porc.

1. Principe

Elle est similaire aux méthodes d'hybridation Southern Blot ou Northern Blot, mais le Western Blot utilise l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide, l'objet à détecter est une protéine, la « sonde » est un anticorps et le « développement » est un anticorps secondaire marqué. L'échantillon de protéines séparé par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) est transféré sur un support en phase solide (comme une membrane de nitrocellulose). Le support en phase solide adsorbe la protéine sous forme de liaisons non covalentes et peut conserver le type de polypeptide séparé par électrophorèse et son activité biologique inchangés. La protéine ou le polypeptide sur le support en phase solide est utilisé comme antigène, qui réagit avec l'anticorps correspondant, puis réagit avec le deuxième anticorps marqué avec une enzyme ou un isotope, et est détecté par développement de couleur du substrat ou radioautographie.

2. Classification

Il existe plusieurs méthodes principales pour le développement du Western Blot :

i. Autoradiographie

ii. Chimiluminescence du substrat ECL

iii. Fluorescence du substrat ECF

iv. Développement de la couleur du substrat DAB

Les méthodes les plus couramment utilisées sont la chimioluminescence du substrat ECL et la colorimétrie DAB du substrat. La première méthode est utilisée pour le même niveau et les mêmes conditions expérimentales, et les articles publiés utilisent généralement la chimioluminescence du substrat ECL. Il suffit d'acheter un kit de test prêt à l'emploi, et le fonctionnement est relativement simple. Le principe est le suivant (l'anticorps secondaire est marqué au HRP) : le substrat de réaction est le peroxyde + luminol. Lorsqu'il rencontre le HRP, il émet de la lumière, ce qui peut exposer le film et laver les bandes. Mesurer les composants protéiques exprimés par des gènes cibles spécifiques séparés par électrophorèse. Cette technique est également largement utilisée pour détecter les niveaux de protéines.

3. Préparation des échantillons

1. Extraction de protéines totales à partir de cellules adhérentes en monocouche :

2. Extraction de protéines totales à partir des tissus :

3. Extraction de protéines totales à partir de cellules adhérentes traitées avec le médicament.

Western blotting, une méthode permettant d'identifier les maladies causées par des gènes mal exprimés. Cet avantage de pouvoir trouver rapidement l’antigène qui cause la maladie et d’avoir l’anticorps spécifique (une protéine) coloré est largement utilisé dans l’étude des maladies génétiques, des problèmes génétiques et de la détection des maladies. Sur la base de sa production, de nouvelles technologies de détection sont également développées, comme la méthode d'hybridation Southern Blot.