Électrophorèse sur gel de polyacrylamide

L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide est une technique d'électrophorèse couramment utilisée qui utilise le gel de polyacrylamide comme support. Il est souvent utilisé pour séparer les oligonucléotides et les protéines. Il est souvent utilisé comme détergent anionique et peut agir comme agent solubilisant et agent texturant. Le rôle de l’empilement est souvent mentionné lorsqu’on parle de la fonction de concentration du gel. Lorsque la concentration est relativement faible, la taille des pores sera relativement grande. Apprenons-en davantage sur cet aspect ci-dessous.

Introduction

Principe d'action : Le gel de polyacrylamide a une structure en réseau et a un effet tamis moléculaire. Il existe deux formes d'électrophorèse : l'électrophorèse en phase gazeuse native et l'électrophorèse en phase gazeuse SDS. Dans l'électrophorèse en phase gazeuse native, les protéines peuvent rester intactes pendant l'électrophorèse et se séparer progressivement selon un gradient en fonction du poids moléculaire, de la forme et de la charge de la protéine.

La SDS-PAGE peut séparer les protéines en fonction uniquement du poids moléculaire de leurs sous-unités. La technologie a été établie pour la première fois par Shapiro en 1967. Ils ont découvert qu'après l'ajout de détergents ioniques et d'agents réducteurs puissants (SDS, dodécyl sulfate de sodium) au milieu d'échantillon et au gel d'acrylamide, la mobilité électrophorétique des sous-unités protéiques dépend principalement de la taille du poids moléculaire de la sous-unité (les facteurs de charge peuvent être ignorés).

effet

Le SDS est un détergent anionique. En tant qu'agent dénaturant et solubilisant, il peut rompre les liaisons hydrogène à l'intérieur et entre les molécules, provoquer le dépliage des molécules et détruire les structures secondaires et tertiaires des molécules de protéines. Les agents réducteurs puissants tels que le mercaptoéthanol et le dithiothréitol peuvent briser les liaisons disulfures entre les résidus de cystéine. Après avoir ajouté des agents réducteurs et du SDS à l'échantillon et au gel, les molécules sont dépolymérisées en chaînes polypeptidiques. Les chaînes latérales d'acides aminés dépolymérisées se combinent au SDS pour former des micelles protéine-SDS. La charge négative qu'elles portent dépasse largement la charge d'origine de la protéine, éliminant ainsi la charge et les différences structurelles entre les différentes molécules.

La SDS-PAGE utilise généralement un système tampon discontinu, qui peut avoir une résolution plus élevée par rapport à un système tampon continu.

La fonction du gel concentré est l'empilement. La concentration du gel est faible et la taille des pores est grande. Lorsqu'un échantillon relativement dilué est ajouté au gel concentré, il est concentré dans une zone étroite grâce à l'effet de migration du gel à gros pores. Lorsque le tampon TRIS/HCl est sélectionné comme solution d'échantillon et gel d'empilement, TRIS/glycine est sélectionné comme solution d'électrode. Une fois l'électrophorèse commencée, le HCl se dissocie en ions chlorure et la glycine se dissocie en une petite quantité d'ions glycine. Les protéines sont chargées négativement, elles se déplacent donc ensemble vers l'électrode positive, les ions chlorure se déplaçant le plus rapidement, les ions glycine le plus lentement et les protéines au milieu. Au début de l'électrophorèse, la mobilité des ions chlorure est la plus importante, dépassant celle des protéines, formant ainsi une zone de faible conductivité à l'arrière. L'intensité du champ électrique est inversement proportionnelle à la zone de faible conductivité, générant ainsi une intensité de champ électrique plus élevée, provoquant le déplacement rapide des protéines et des ions glycine, formant une interface stable, provoquant l'agrégation des protéines près de l'interface mobile et leur condensation en une couche intermédiaire.

Dans cette méthode d’identification, la mobilité d’une protéine dépend principalement de sa masse moléculaire relative et n’a rien à voir avec sa charge et sa forme moléculaire.